單細(xì)胞多組學(xué)高通量測序平臺（二）
雖然single-cell sequencing的方法仍在不斷推出，但是目前使用最為廣泛、商業(yè)化成熟的方法仍是10×Genomics公司推出的ChromiumTM系統(tǒng)。
1.2以RNA-seq為例介紹高通量單細(xì)胞測序技術(shù)
單細(xì)胞測序的最主要難點(diǎn)是如何在短時(shí)間內(nèi)分離得到最可能多的單個(gè)細(xì)胞，早期的技術(shù)代表Fluidigm C1平臺大約在幾個(gè)小時(shí)中可以捕獲96個(gè)左右的細(xì)胞，之后再進(jìn)行建庫和測序。而現(xiàn)在主流測序平臺10×Genomics則是基于類似2015年發(fā)表的drop-seq技術(shù)原理得到單細(xì)胞，細(xì)胞準(zhǔn)備時(shí)長在2小時(shí)左右，可捕獲500-10000個(gè)細(xì)胞，在時(shí)長和細(xì)胞數(shù)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于C1技術(shù)。
1.2.1 10×Genomics技術(shù)介紹
10×Genomics公司推出的ChromiumTM系統(tǒng)其技術(shù)核心是油滴包裹的凝膠珠（Gel Bead in Emulsion, GEM）。該技術(shù)可以解決核心難點(diǎn)：快速高效分離細(xì)胞并將細(xì)胞和下一步反應(yīng)所需試劑混合。該系統(tǒng)有75萬種帶有條形碼的凝膠珠（barcoded gel beads），每個(gè)凝膠珠上有40-80萬探針。每個(gè)探針含有四段各司其職的重要序列，下面對四段序列一一介紹。
凝膠珠示意圖 圖片來源：10×Genomics文檔 探針資本
探針資本整理
帶有條形碼的凝膠珠通過橫向孔道進(jìn)入微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)，在第一個(gè)十字處，細(xì)胞通過縱向孔道運(yùn)至交叉處，細(xì)胞與凝珠通過碰撞吸附在一起，繼續(xù)行進(jìn)至第二個(gè)十字處，進(jìn)入油相，包裹形成油滴。通過此過程完成單細(xì)胞的分離和混合反應(yīng)試劑的重要步驟，即含Barcoded RT Primers的Gel Beads、細(xì)胞和酶的混合物，三者結(jié)合形成GEMs，即包裹Gel Beads、細(xì)胞和酶的混合物的油滴。
10×系統(tǒng)GEM形成流程 資料來源：10×Genomics官網(wǎng) 探針資本
GEM形成后，細(xì)胞裂解，通過一系列反應(yīng)構(gòu)建文庫，構(gòu)建好的文庫即可通過高通量測序儀測序獲得序列信息，根據(jù)序列的BC可將序列分至一個(gè)個(gè)單細(xì)胞，根據(jù)UMI，可去除掉PCR擴(kuò)增引入的重復(fù)，獲得每個(gè)基因的準(zhǔn)確表達(dá)量。具體建庫流程如下：1）凝膠珠溶解釋放大量barcode序列；2）隨后mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA；3）油滴破碎，cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4） cDNA打斷、加測序接頭等傳統(tǒng)二代測序的建庫過程。
10×單細(xì)胞建庫流程框架 探針資本整理
10×單細(xì)胞建庫流程 10×Genomics官網(wǎng) 探針資本
1.2.2其他主流技術(shù)介紹：BD Rhapsody平臺
BD在單細(xì)胞捕獲時(shí)不再采用微流控孔道技術(shù)，而是使用CytoSeq蜂窩板技術(shù)，通過超過量的微孔保證細(xì)胞極大概率被單個(gè)投入微孔中，從而達(dá)到了分離單細(xì)胞的目的。在分離得到單細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞裂解，反轉(zhuǎn)等常規(guī)建庫流程。
BD Rhapsody平臺 單細(xì)胞mRNA抓取過程 圖片來源：烈冰科技
1.3其他單細(xì)胞測序技術(shù)
1.3.1 Single-cell ATAC-seq
染色質(zhì)開放性測序技術(shù)（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，ATAC sequencing）是借助轉(zhuǎn)座酶獲得染色質(zhì)開放性區(qū)域序列的高通量測序技術(shù)。該技術(shù)于2013年，由美國斯坦福大學(xué)的William Greenleaf教授研發(fā)。基因表達(dá)需要相關(guān)蛋白（轉(zhuǎn)錄因子TF）結(jié)合染色質(zhì)DNA，打開DNA雙鏈之后，再由RNA合成酶介導(dǎo)合成RNA。染色體絕大部分區(qū)域是緊密折疊的，僅有一小部分比較松散，而這部分松散（開放、易接近）區(qū)域往往是轉(zhuǎn)錄發(fā)生調(diào)控區(qū)域，是研究基因表達(dá)調(diào)控的重要區(qū)域。轉(zhuǎn)座酶可以接近并且結(jié)合在松散DNA上，通過改造使其攜帶并將接頭序列插入在基因組的開放區(qū)域，再通過特異性結(jié)合接頭序列的引物擴(kuò)增片段，高通量測序之后便可獲得轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置，開放程度等轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵信息。
ATAC Sequencing 原理 圖片來源：Genewiz 探針資本
10×Genomics開發(fā)的The Chromium Single Cell ATAC Solution是基于Chromium系統(tǒng)，思路與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序相似，不同之處是樣品為細(xì)胞核，并且在制備樣品時(shí)加入轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行插入和連接接頭步驟，之后使用相同的流程完成單細(xì)胞核建庫。
10×Genomics ATAC-seq 流程 圖片來源：10×Genomics官網(wǎng)
1.3.2單細(xì)胞甲基化測序
DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化學(xué)修飾之一，指DNA的CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。DNA甲基化是研究最為廣泛的表觀修飾，DNA甲基化修飾的存在使得相同序列可以具有不同功能，獲得修飾的胞嘧啶所在區(qū)域的結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象和穩(wěn)定性等都會受到改變，從而影響基因表達(dá)。
DNA甲基化修飾（DNA methylation）檢測方法按照是否使用亞硫酸鹽可以分為兩類，其中金標(biāo)準(zhǔn)是亞硫酸鹽測序（bisulfite sequencing）。DNA經(jīng)亞硫酸鹽處理后，非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏け３植蛔?。?jīng)過PCR擴(kuò)增、測序等步驟，并與參考序列（未經(jīng)處理）的序列進(jìn)行比對，若參考序列為C，而測序結(jié)果中為T，則判斷是未發(fā)生甲基化的位點(diǎn)；參考序列和測序結(jié)果均為C，則判斷是發(fā)生甲基化的位點(diǎn)。
亞硫酸鹽測序示意圖 圖片來源：diagenode官網(wǎng)
由于亞硫酸鹽會導(dǎo)至DNA降解，使得單細(xì)胞水平低起始量的甲基化測序難以實(shí)現(xiàn)。直至2013年，湯富酬團(tuán)隊(duì)發(fā)明了單細(xì)胞RRBS（single-cell Reduced representation bisulfite sequencing）技術(shù)。該技術(shù)通過將所有反應(yīng)整合在一個(gè)體系中完成優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方法。
Single-cell RRBS流程 圖片來源：Genome Research
雖然亞硫酸鹽導(dǎo)至DNA降解的問題被緩解，但其仍然存在，并且不同位點(diǎn)轉(zhuǎn)化的比例差異較大，使得檢測得到的結(jié)果并不穩(wěn)定。而利用APOBEC胞嘧啶脫氨酶選擇性將沒有修飾的C變?yōu)閁，最終測序?yàn)門，與參考序列比對，則可得到甲基化位點(diǎn)。該方法使用甲基化修飾酶對DNA損傷小，但由于酶對于C的修飾效率受限，基于酶的測序方法需要根據(jù)片段大小調(diào)整酶量，從而獲得較高的分辨率。
亞硫酸鹽測序和Enzymatic Methyl-seq對比
圖片來源：New England Biolabs 官網(wǎng)
1.3.3單細(xì)胞蛋白組測序
質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）是目前最常使用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，它無需標(biāo)記，可分析整個(gè)蛋白質(zhì)組。然而質(zhì)譜的靈敏度不高，檢測群體細(xì)胞蛋白質(zhì)組時(shí)，通常需要上萬個(gè)細(xì)胞的蛋白總量，所以在檢測單細(xì)胞時(shí)，由于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量大大降低，使用質(zhì)譜法檢測單細(xì)胞蛋白質(zhì)組仍需要方法上的改進(jìn)。
2011年，來自斯坦福大學(xué)的Sean C. Bendall等人結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)，發(fā)明了質(zhì)量流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF），其原理如圖所示，首先利用含不同過渡金屬同位素標(biāo)簽的抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，被標(biāo)記好的細(xì)胞隨后進(jìn)入質(zhì)譜流式細(xì)胞儀，逐個(gè)噴出單細(xì)胞微滴，進(jìn)入電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）裝置，通過定量過渡金屬元素標(biāo)簽從而得知每個(gè)細(xì)胞中各個(gè)結(jié)合蛋白的含量。由于金屬離子的非特異性結(jié)合極低，方法的敏感性大幅提升。
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