加標(biāo)回收率總做不好？問(wèn)題可能出在這里
在實(shí)驗(yàn)室里，加標(biāo)回收率不理想是一項(xiàng)頂讓人頭痛的事情，因?yàn)樗碇@次實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果不一定正確，而在實(shí)驗(yàn)操作步驟完全正確的情況下，進(jìn)行問(wèn)題排查又非常復(fù)雜。那么，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)要怎么做?哪些地方最容易因起加標(biāo)實(shí)驗(yàn)失敗呢?
加標(biāo)回收率的大小不僅反應(yīng)了分析人員的操作技術(shù)水平，更重要的是它反應(yīng)了分析方法是否適合被測(cè)基體，幫助分析人員及時(shí)地發(fā)現(xiàn)分析中存在的問(wèn)題，確保分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。
首先，我們要知道什么是加標(biāo)回收率?加標(biāo)回收率就是在測(cè)定樣品的同時(shí)，于一樣品的子樣中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，將其測(cè)定結(jié)果扣除樣品的測(cè)定值，而得到加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率。
又分為空白加標(biāo)回收和樣品加標(biāo)回收兩種。
【空白加標(biāo)回收】在沒(méi)有被測(cè)物質(zhì)的空白樣品基質(zhì)中加入定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按樣品的處理步驟分析，得到的結(jié)果與理論值的比值即為空白加標(biāo)回收率。 【樣品加標(biāo)回收】相同的樣品取兩份，其中一份加入定量的待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);兩份同時(shí)按相同的分析步驟分析，加標(biāo)的一份所得的結(jié)果減去未加標(biāo)一份所得的結(jié)果，其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的理論值之比即為樣品加標(biāo)回收率。
計(jì)算方法及數(shù)學(xué)表達(dá)式
其計(jì)算公式為：
回收率P=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)/加標(biāo)量×100%
【理論公式使用的前提條件】文獻(xiàn)中對(duì)加標(biāo)回收率的解釋是:“在測(cè)定樣品的同時(shí), 于同一樣品的子樣中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定, 將其測(cè)定結(jié)果扣除樣品的測(cè)定值, 以計(jì)算回收率。”因此，使用理論公式時(shí)應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足以下2個(gè)條件：①同一樣品的子樣取樣體積必須相等;②各類(lèi)子樣的測(cè)定過(guò)程必須按相同的操作步驟進(jìn)行; 【理論公式使用的約束條件】文獻(xiàn)中強(qiáng)調(diào)指出：加標(biāo)量不能過(guò)大，一般為待測(cè)物含量的0.5～2.0倍，且加標(biāo)后的總含量不應(yīng)超過(guò)方法的測(cè)定上限;加標(biāo)物的濃度宜較高，加標(biāo)物的體積應(yīng)很小，一般以不超過(guò)原始試樣體積的1%為好。 【理論公式的不足之處】各文獻(xiàn)對(duì)公式中“加標(biāo)量”一詞的定義，均未準(zhǔn)確給定，使其含義不是十分明確。從公式的分子上分析，加標(biāo)量應(yīng)為濃度單位;從公式的分母上理解，應(yīng)為加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值，為質(zhì)量單位。
若公式中的加標(biāo)量為濃度單位，此時(shí)的加標(biāo)量并不是指標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，而應(yīng)該是加標(biāo)體積所含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值除以試樣體積(或除以試樣體積與加標(biāo)體積之和)所得的濃度值。這里存在著濃度換算，而在理論公式中并沒(méi)有明確予以表現(xiàn)出來(lái)。
【以濃度值計(jì)算加標(biāo)回收率理論公式】P=(c2-c1)/c3× 100%式中：P為加標(biāo)回收率;c1 為試樣濃度, 即試樣測(cè)定值, c1 = m1/V1;c2 為加標(biāo)試樣濃度，即加標(biāo)試樣測(cè)定值，c2 = m2/V2;c3 為加標(biāo)量，c3 = c0 ×V0/V2：m = c0 ×V0;m1 為試樣中的物質(zhì)含量;m2為加標(biāo)試樣中的物質(zhì)含量;m為加標(biāo)體積中的物質(zhì)含量;V1 為試樣體積;V2 為加標(biāo)試樣體積，V2 = V1 + V0;V0 為加標(biāo)體積;c0 為加標(biāo)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。 【以吸光度值計(jì)算加標(biāo)回收率】本方法僅限于用光度法分析樣品時(shí)使用，在光度法分析過(guò)程中，會(huì)用到校準(zhǔn)曲線Y=bx+a，導(dǎo)出量值公式為：x=Y–a/b 1、計(jì)算結(jié)果不受加標(biāo)體積影響的情況(1) 樣品分析過(guò)程中有蒸發(fā)或消解等可使溶液體積縮小的操作技術(shù)時(shí)，盡管因加標(biāo)而增大了試樣體積，但樣品經(jīng)處理后重新定容并不會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生影響。比如采用酚二磺酸分光光度法分析水中的硝酸鹽氮(GB7480287)，樣品及加標(biāo)樣品經(jīng)水浴蒸干后，需要重新定容到50 mL再行測(cè)定。 (2) 樣品分析過(guò)程中可以預(yù)先留出加標(biāo)體積的項(xiàng)目，比如采用離子選擇電極法分析水中的氟化物(GB7484287) ，當(dāng)樣品取樣量為35mL、加標(biāo)樣取5.0mL以?xún)?nèi)時(shí), 仍可定容在50mL，對(duì)分析結(jié)果沒(méi)有影響。 (3) 當(dāng)加標(biāo)體積遠(yuǎn)小于試樣體積時(shí)，可不考慮加標(biāo)體積的影響，比如采用4-氨基安替比林萃取光度法分析水中的揮發(fā)酚(GB7490287)，加標(biāo)體積若為1.0 mL，而取樣體積為250 mL時(shí)，加標(biāo)體積引起的誤差可以忽略不計(jì)。 2、標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入方法加標(biāo)回收率是控制樣品前處理好壞的依據(jù)，應(yīng)該在樣品處理前加入。相同的樣品取兩份，其中一份加入定量的待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，兩份同時(shí)按相同的分析步驟分析。加標(biāo)回收率=(加標(biāo)樣品的結(jié)果-未加標(biāo)樣品)/加標(biāo)理論值。
影響加標(biāo)回收率值的因素
1、分析方法及實(shí)驗(yàn)條件
有的項(xiàng)目由于分析方法有局限，而造成加標(biāo)回收率值較低;由于實(shí)驗(yàn)條件(裝置、儀器等)較差，對(duì)加標(biāo)回收值的影響也較大，例如：水中硫化物的測(cè)定。
2、樣品中的本底值一般在分析方法適用濃度范圍的中、高濃度水平，加標(biāo)回收率與濃度水平關(guān)系不大。但是，在低濃度區(qū)加標(biāo)回收率要受樣品中本底值的影響。通常，樣品中本底值越低，加標(biāo)回收率越低。
3、加標(biāo)量對(duì)加標(biāo)回收率的影響a、加入過(guò)多或過(guò)少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均不能保證加標(biāo)樣品和樣品中所含待測(cè)物濃度在相同的精密度范圍內(nèi);b、當(dāng)樣品中待測(cè)物含量較高時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過(guò)高，使加標(biāo)后測(cè)定值接近方法的檢出上限，這樣測(cè)得加標(biāo)樣中待測(cè)物的誤差較大，加標(biāo)后引起的濃度增量在方法測(cè)定上限濃度C 的0.4～0.6倍之間為宜;c、當(dāng)樣品中待測(cè)物含量較低時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)太少，測(cè)得回收率值較差;加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)太多則會(huì)改變待測(cè)物質(zhì)在加標(biāo)樣品和樣品中的測(cè)定背景;d、當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是有機(jī)溶劑時(shí)，加標(biāo)量過(guò)多，則會(huì)造成溶劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以在水中溶解，從而因溶解度問(wèn)題造成對(duì)加標(biāo)回收率的影響。
如何進(jìn)行加標(biāo)回收率的測(cè)定
加標(biāo)回收率的測(cè)定可以和平行樣的測(cè)定相同，一般多按隨機(jī)抽取10%～20%的樣品量做加標(biāo)回收率測(cè)定。
例如，有10個(gè)樣品待測(cè)定，則可以從中隨機(jī)抽出2個(gè)樣品做加標(biāo)回收率測(cè)定。抽出的2個(gè)樣品各取4份，其中兩份做平行本底測(cè)定，另兩份做平行加標(biāo)回收率測(cè)定。
加標(biāo)回收率的測(cè)定往往由于樣品中待測(cè)物質(zhì)含量未知，難以估計(jì)加標(biāo)量，需預(yù)先測(cè)定樣品含量，再作回收率測(cè)定。由于加標(biāo)回收率受加標(biāo)量大小的影響，因此，必須對(duì)加標(biāo)量有所規(guī)定：(1)加標(biāo)物質(zhì)的形態(tài)應(yīng)該和待測(cè)物的形態(tài)相同。(2)加標(biāo)樣品和樣品中待測(cè)物濃度應(yīng)控制在精密度相當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。
一般情況下規(guī)定：a. 加標(biāo)量應(yīng)盡量與樣品中待測(cè)物質(zhì)含量相等或相近，并應(yīng)注意對(duì)樣品容積的影響;b. 當(dāng)樣品中待測(cè)物質(zhì)含量接近方法檢出限時(shí)，加標(biāo)量應(yīng)控制在校準(zhǔn)曲線的低濃度范圍;當(dāng)樣品中待測(cè)物含量小于方法檢出限時(shí)，以檢出限的量作為待測(cè)物質(zhì)的含量加標(biāo);c. 一般加標(biāo)量不得大于待測(cè)物含量的3倍;d. 加標(biāo)后的測(cè)定值不應(yīng)超出方法的測(cè)定上限的90%;e. 當(dāng)樣品中待測(cè)物濃度高于校準(zhǔn)曲線的中間濃度時(shí)，加標(biāo)量應(yīng)控制在待測(cè)物濃度的半量。
加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果判斷
結(jié)果判斷的一般方法加標(biāo)回收率測(cè)定所得結(jié)果一般按方法規(guī)定的水平進(jìn)行判斷，或在質(zhì)量控制圖中檢驗(yàn)。在沒(méi)有這兩項(xiàng)依據(jù)時(shí)，可按95%～105%的域限做判斷標(biāo)準(zhǔn)，超出此域限的，再按測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差、自由度、給定的置信限和加標(biāo)量計(jì)算加標(biāo)回收率的可按受域P。
計(jì)算公式為：
注意事項(xiàng)
1、加標(biāo)物的形態(tài)應(yīng)和待測(cè)物的形態(tài)相同。 2、加標(biāo)量應(yīng)和樣品中所含待測(cè)物的測(cè)量精密度控制在相同的范圍內(nèi)，一般情況下作如下規(guī)定： (1)加標(biāo)量應(yīng)盡量與樣品中待測(cè)物含量相等或相近，并應(yīng)注意對(duì)樣品容積的影響; (2)當(dāng)樣品中待測(cè)物含量接近方法檢出限時(shí)，加標(biāo)量應(yīng)控制在校準(zhǔn)曲線的低濃度范圍; (3)在任何情況下加標(biāo)量均不得大于待測(cè)物含量的3倍; (4)加標(biāo)后的測(cè)定值不應(yīng)超出方法的測(cè)定上限的90%; (5)當(dāng)樣品中待測(cè)物濃度高于校準(zhǔn)曲線的中間濃度時(shí)，加標(biāo)量應(yīng)控制在待測(cè)物濃度的半量。
思考與討論
由于加標(biāo)樣和樣品的分析條件完全相同，其中干擾物質(zhì)和不正確操作等因素所導(dǎo)致的效果相等。當(dāng)以其測(cè)定結(jié)果的減差計(jì)算回收率時(shí)，常不能確切反映樣品測(cè)定結(jié)果的實(shí)際效果。
